Laporan Praktikum 20 Maret 2009
m.k. Dasar-dasar Genetika Ikan
PREPARASIKROMOSOM TEKNIK JARINGAN PADAT
Rani Rehulina Tarigan, C14070045,Kelompok 5, Shift 2
Abstrak
Penghitungankromosom dapat dilakukan melalui kultur jaringan padat. Kromosom tampak jelaspada saat pembelahan sel yaitu pada saat metapase. Ikan yang akan diuji adalahikan nila dan ikan lele,yang akan ditentukan jumlah kromosomnya . Preparasiteknik jaringan padat ini bertujuan untuk menentukan tingkat ploidi dankarakteristik suatu spesies yang dikenal dengan teknik karyotip. Larutan yang digunakan adalah kolkisin,hipotonik , carnoy dan giemsa, Perlakuan hipotonik bertujuan agar sel-selmembesar dan kromosom menyebar letaknya. Fiksasi merupakan perlakuan untukmematikan sel tanpa merusak bentuk dan kandungannya. Giemsa merupakan pewarnayang paling sering digunakan untuk mewarnai kromosom, Untuk melihat bentukserta ukuran kromoson ada baiknya dilakukan pada saat pemelahan metapasekarena pada tahap ini kromosomberkontraksi maksimal dan tampak sangat jelas sekali. Data yang didapatmenunjukkan bahwa pada ikan nila jumlah kromosomnya adalah 41 sedangkan padaikan lele jumlah kromosom lebih banyak yaitua 74. Kesimpulan bahwa teknikkultur jaringan padat dapat dilakukanperhitungan kromosom.
Kata kunci: kromosom
Pendahuluan
Kromosom adalah badan mikroskopis dalam intisel yang merupakan struktur sel paling penting yang bertugas untuk menurunkansifat kepada keturunan (Kirpichnikov, 1981; Tave, 1986; Pai, 1987; Suryo, 1994 dalam Sucipto, 2008). Kromosom yangterdapat pada sebuah sel haploid tidak pernah memiliki ukuran dan sifat yangsama. Di dalam kromosom terdapat genyang mengandung DNA yang terbalut dalamsatu atau lebih kromosom. Gen-gen menempati posisi tertentu (lokus) dalamkromosom dan mengandung cetak biru berupa kode sifat biologis untuk memproduksifenotipe. Panjang rangkaian DNA akan menentukan ukuran kromosom dan hal ini bervariasi antara suatu spesiesdengan spesies yang lain. Panjang kromosom berkisar antara 0.2-20 m (Suryo,1994 dalam Sucipto, 2008).
Perhitungankromosom dapat dilakukan melalui kultur jaringan padat dan diharapkan mendapanhasil yang akurat. Pengamatan kromosom berguna untuk menentukan bentuk danjumlah kromosom serta penentuan ploidi. Tahapan-tahapan yang digunakan padateknik jaringan padat meliputi perlakuan kolkisin, perlakuan hipotonik,fiksasi, pembuatan preparat, pewarnaan dan pengamatan.
Praktikumkali ini bertujuan untuk menentukan tingkat ploidi (diploid, triploid dansebagainya) dan menentukan karakteristik suatu spesies yang dikenal denganteknik karyotip.
Metodologi
Bahanyang digunakan dalam praktikum adalah kolkisin (C22H25NO6),etanol (C2H5OH), kalium klorida (KCL), asam asetatglasial (CH3COOH). giemsa,akuades,insang,sirip ikan nila (Oreochromis niloticus) serta bagianposterior dan anterior ikan lele (Clariasbatrachus), Sedangkan alat-alat yangdigunakan adalah timbangan, mikroskop binokuler, hot plate, kertas tissue, gelas obyek, alat bedah (pinset dan pisaubedah), pipet tetes dan gelas obyek cekung.
Adapun prosedur yang di lakukan adalahdengan ikan dalam larutan Kolkisin 0.07% (w/v) selama 6-9 jam untuk memutusbenang Spindel dan menghentikan pembelakah sel pada tahap metafase. Selamaperendaman dalam wadah, ikan diberi aerasi yang baik setelah itu ikan dibunuh.Kemudian sirip ekor dan insang ikan dipotong. Potongan jaringan tersebutdirendam dalam larutan hipotonik (KCl 0.075 M) selama 60 menit pada suhu ruangdengan tujuan menggelembungkan ukuran sel sehingga kromosom memiliki ruang yanglebih luas untuk diamati. Larutan hipotonik diganti setiap 30 menit selamawaktu perendaman dengan volume 20 kali volume jaringan. Lalu jaringan difiksasidengan larutan Carnoy selama 60 menit untuk menjaga keutuhan kromosom. LarutanCarnoy diganti setiap 30 menit. Kemudian dilanjutkan dengan pembuatan preparat(bila diperlukan jaringan yang telah difiksasi dapat disimpan dalam refrigratorselama 2 - 3 minggu).
Pada tahap pembuatan preparat, jaringan yang telah difiksasi diambil denganmenggunakan pinset dan disentuhkan pada tissue untuk menghilangkan larutanfiksasi. Kemudian jaringan tersebut diletakkan di atas gelas objek cekung danditambahkan 3 - 4 tetes Asam Asetat 50%. Setelah itu jaringan digerak-gerakkandengan menggunakan pisau bedah secara hati-hati hingga terbentuk suspensi sel(larutan menjadi keruh). Gelas objek yang akan digunakan sebagai preparatsebelumnya direndam di dalam alkohol 70% minimal selama 2 jam. Suspensi selyang terbentuk diambil dengan menggunakan pipet tetes lalu diteteskan di atasgelas objek yang ditempatkan diatas hot plate dengan suhu 45-500C, dan dihisapkembali dengan cepat setelah terbentuk lingkaran (ring). Pada setiap gelasobjek idealnya dapat dibuat menjadi 3 lingkaran.
Selanjutnya pada tahap pewarnaan preparat, preparat yang telah berisi lingkarandiwarnai dengan larutan giemsa 20% dengan cara memberikan larutan sebanyak 3 -5 tetes lalu disebarkan hingga menutupi ring dengan menggunakan tusuk gigi.Pewarnaan dilakukan selama 20 - 30 menit pada suhu kamar. Preparat dibilasdengan menggunakan akuades selama 20 - 30 menit pada suhu kamar. Setelahkering, preparat diamati di bawah
Pada tahap pembuatan preparat, jaringan yang telah difiksasi diambil denganmenggunakan pinset dan disentuhkan pada tissue untuk menghilangkan larutanfiksasi. Kemudian jaringan tersebut diletakkan di atas gelas objek cekung danditambahkan 3 - 4 tetes Asam Asetat 50%. Setelah itu jaringan digerak-gerakkandengan menggunakan pisau bedah secara hati-hati hingga terbentuk suspensi sel(larutan menjadi keruh). Gelas objek yang akan digunakan sebagai preparatsebelumnya direndam di dalam alkohol 70% minimal selama 2 jam. Suspensi selyang terbentuk diambil dengan menggunakan pipet tetes lalu diteteskan di atasgelas objek yang ditempatkan diatas hot plate dengan suhu 45-500C, dan dihisapkembali dengan cepat setelah terbentuk lingkaran (ring). Pada setiap gelasobjek idealnya dapat dibuat menjadi 3 lingkaran.
Selanjutnya pada tahap pewarnaan preparat, preparat yang telah berisi lingkarandiwarnai dengan larutan giemsa 20% dengan cara memberikan larutan sebanyak 3 -5 tetes lalu disebarkan hingga menutupi ring dengan menggunakan tusuk gigi.Pewarnaan dilakukan selama 20 - 30 menit pada suhu kamar. Preparat dibilasdengan menggunakan akuades selama 20 - 30 menit pada suhu kamar. Setelahkering, preparat diamati di bawah
Hasil dan Pembahasan
Jumlah kromoson yang terdapat dalam setiap Padakromosom yang bentuk yang sama disebut kromosom yang homolog, sedangkan yangberda pada lokus yang sam disebit kromosom yang sealel dan biasa terdapat padasel diploid. Setiap organisme memiliki jumlah kromosom yang berbeda –beda, olehsebab itu penting dilakukan rekayasa genetik melalui pembelajatan sertapenelitian. Kromosom mempunyai struktur halus yang mengandung untaian kromatityang sangat padat selama pembentukan sel. Kromosom juga mengandung cetak biruatau kode biologi untuk menghasilkan fenotip. Berdasarkan tipe, kromosomterdiri dari autosom (krmosom tubuh) dan gonosom (kromosom seks). Kromosom seksdigunakan untuk menentukan jenis kelamin. Sepasang kromosom seks ikan jantandan betina berbeda secara morfologi.
Kromosomyang digunakan pada praktikum ini merupakan sampel kromosom dari sirip daninsang ikan nila (Orechromis niloticus)dan bagian posterior dan anterior ikan lele (Clarias batrachus) karena pada bagian ini sel sangat cepatmelakukan pembelahan dan insang digunakan karena pada organ ini sangat banyakditemukan oksigen. Jumlah kromosom ikan nila diploid sebanyak 44 buah,sedangkan jumlah kromosom ikan nila tetraploid berjumlah 88 buah.Pada tabel 1 jumlah kromosom ikan nila dalah 41 buahdan jumlah kromosom pada ikan lele sebesar 74 buah.
Larutan-larutanyang digunakan pada tahapan preparasi kromosom teknik jaringan padat adalahkolkisin, hipotonik, Carnoy dan Giemsa. Kolkisin adalah suatu alkaloida hasilekstraksi umbi tanaman Colcicum autumnale yang berpengaruh unik, yaitumeniadakan pembentukan gelendong inti dan menghentikan pembelahan mitosis padastadium metafase, fase dimana kromosom berkontraksi maksimal dan tampak palingjelas. Konsentrasi normal yang biasa digunakan untuk jaringan ikan berkisarantara 0.01-0.1% untuk perriode waktu 1-6 jam . Selain kolkisin dapat juga menggunakankolesmid, velban, asenaften, kloral hidrat, coumarin dan askalin (Suryo, 1994 dalam Sucipto, 2008).
Analisis karyotip bermanfaat untuk mengetahuiadanya penyakit genetik, mutasi kromosom, mengidentifikasi spesies, pemantauanjenis kelamin dan mengidentifikasi tingkat ploidi suatu organisme Larutan Kolkisinadalah suatu alkaloida hasil ekstraksi umbi tanaman Colcicum autumnale yangberpengaruh unik, yaitu meniadakan pembentukan gelendong inti dan menghentikanpembelahan mitosis pada stadium metafase, fase dimana kromosom berkontraksimaksimal dan tampak paling jelas. Konsentrasi normal yang biasa digunakan untukjaringan ikan berkisar antara 0.01-0.1% untuk perriode waktu 1-6 jam . Selainkolkisin dapat juga menggunakan kolesmid, velban, asenaften, kloral hidrat,coumarin dan askalin (Suryo, 1994 dalamSucipto, 2008).
Perlakuanhipotonik bertujuan agar sel-sel membesar dan kromosom menyebar letaknya.Larutan hipotonik dapat dibuat dari campuran akuades, sodium sitrat danpotassium klorid. Lama perlakuan bergantung pada suhu dan konsistensi jaringan atau sel yang digunakan. Fiksasimerupakan perlakuan untuk mematikan sel tanpa merusak bentuk dan kandungannya.Larutan fiksatif yang paling sering digunakan adalah campuran methanol denganasam asetat glasial atau sering disebut juga larutan Carnoy. Larutan ini harusdalam keadaan segar jika digunakan. Giemsa merupakan pewarna yang paling seringdigunakan untuk mewarnai kromosom, meskipun mekanisme pewarnaannya tidakbersih. Komponen aktif Giemsa berupa molekul eosin Y dan biru metilen. Kualitashasil pewarnaan bervariasi tergantung perbandingan pewarna yang digunakan(Anonim, 2009).
Tabel1. Hasil Pengamatan Kromosom Ikan Nila
| Kelompok | Ikan Nila Oreochromis niloticus | |||
| Sirip 1 | Sirip 2 | Insang 1 | Insang 2 | |
| 1 | 0/0/0 | 0/0/0 | 0/0/Φ | 0/0/0 |
| 2 | 0/0/0 | 0/0/0 | 47/25/27 | 0/0/0 |
| 3 | 12/0/0 | - | 41/Φ/Φ | - |
| 4 | 0/0/0 | - | 43/Φ/0 | 41/44/0 |
| 5 | 0/0/0 | - | 0/0/0 | 0/0/0 |
| 6 | - | 0/0/0 | 0/0/0 | 0/0/0 |
| 7 | 0/0/0 | - | 0/0/0 | 0/0/0 |
jumlah kromosom nila : 41(yang sering muncul)
Tabel2. Hasil Pengamatan Kromosom Ikan Lele
| Kelompok | Ikan Lele Clarias batrachus | ||
| Posterior | Anterior | ||
| 1 | 0/0/0 | 0/0/0 | |
| 2 | 0/0/74 | 0/0/0 | |
| 3 | 0/0/0 | 0/0/0 | |
| 4 | 0/0/0 | 0/0/0 | |
| 5 | Φ/Φ/Φ | 0/0/0 | |
| 6 | 0/0/0 | 0/0/0 | |
| 7 | Φ/0/0 | 0/0/0 | |
jumlah kromosom lele : 74 (nilai yang ada)
Kesimpulan
Preparasi kromosom teknikjaringan padat yang telah dilakukan membantu proses untuk menentukan tingkatploidi (diploid, triploid dan sebagainya) dan karakteristik suatu speies yangdikenal dengan teknik karyotip
Daftar Pustaka
Anonim.2009. Kromosom. http://id.wikipedia.org/wiki/Kromosom(16 Maret 2009)
SuciptoA. 2008. Kromosom dan Karyotip.http://naksara.net(16 Maret 2009)
Daisi, P. 1994. Teknik Kultur Jaringan
. Yogyakarta ; Kanisius.
